Alles zien Auteurs en affiliaties verbergen

Bewerkt door Andrej Sali, University of California, San Francisco, CA, en goedgekeurd op 27 oktober 2021 (ontvangen voor beoordeling 24 juli 2021)

De ziekte van Alzheimer is een van de grootste wereldwijde gezondheidsuitdagingen. Neuronale celdisfunctie en dood zijn verbonden met de zelfassemblage van het amyloïde peptide (Aβ42) in oligomere en fibrillaire aggregaten. Het fibriloppervlak kan de vorming van giftige oligomeren katalyseren via secundaire kiemvorming. Toegang tot een structuur met hoge resolutie van Aβ42-fibrillen zou een waardevolle basis vormen voor het ontwerp van remmers van de vorming van oligomeren en toxiciteit in de vorm van fibrilbinders en zou dus aanzienlijk bijdragen aan de ontwikkeling van therapieën tegen de ziekte van Alzheimer. Een combinatie van methoden kan voor dit doel het meest vruchtbaar zijn. We laten zien dat kleine-hoek röntgenverstrooiingsgegevens, in combinatie met een vaste stof NMR-structuur van de filamentkern, een gedetailleerd fibrilmodel kunnen onthullen.

Amyloïde fibrillen zijn geassocieerd met een aantal neurodegeneratieve ziekten, waaronder fibrillen van amyloïde β42-peptide (Aβ42) bij de ziekte van Alzheimer. Deze fibrillen zijn een bron van toxiciteit voor neuronale cellen door middel van oppervlaktegekatalyseerde vorming van toxische oligomeren. Gedetailleerde kennis van de fibrilstructuur kan dus de therapeutische ontwikkeling vergemakkelijken. We gebruiken kleine-hoekverstrooiing om informatie te verschaffen over de afmeting en vorm van de fibrildoorsnede voor Aβ42-fibrillen die zijn bereid in waterige fosfaatbuffer bij pH = 7,4 en pH 8,0 onder rustige omstandigheden bij 37 ° C van zuiver recombinant Aβ42-peptide. Het passen van de gegevens met behulp van een continuümmodel onthult een elliptische dwarsdoorsnede en een peptidemassa per lengte-eenheid die compatibel is met twee filamenten van twee monomeren, vier monomeren per vlak. Om een ​​meer gedetailleerd atomistisch model te verschaffen, werden de gegevens gefit met als starttoestand een structuur met hoge resolutie van de twee-monomeerrangschikking in filamenten van vaste stof NMR (Protein Data Bank ID 5kk3). Ten eerste werd een tweevoudig symmetrisch model met residuen 11 tot 42 van twee monomeren in het filament geoptimaliseerd in termen van draaihoek en lokale pakking met Rosetta. Vervolgens werd een model met twee filamenten gebouwd en geoptimaliseerd door aanpassing aan de verstrooiingsgegevens, waardoor de twee N-termini in elk filament verschillende conformaties konden aannemen, met dezelfde conformatie in elk van de twee filamenten. Dit verschaft een atomistisch model van de fibril met tweevoudige rotatiesymmetrie rond de fibril-as. Intrigerend genoeg werd er geen polydispersiteit met betrekking tot het aantal filamenten waargenomen in ons systeem over afzonderlijke monsters, wat suggereert dat de opstelling met twee filamenten een minimum aan vrije energie vertegenwoordigt voor de Aβ42-fibril.

De associatie van neurodegeneratieve ziekten met amyloïde afzettingen heeft het onderzoek naar fibrilstructuren over een reeks lengteschalen gestimuleerd (1⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –8). De ziekte van Alzheimer (AD) is de meest voorkomende vorm van dementie, die een grote impact heeft op de getroffen personen en hun verzorgers, evenals op de economie van de samenleving. Wereldwijd worden meer dan 50 miljoen mensen gediagnosticeerd met AD, en het aantal zal naar verwachting verdubbelen in 2050, wat betekent dat wereldwijd 1 persoon op 85 de ziekte zal krijgen (9, 10).

Eerdere studies hebben aangetoond dat metabolieten van het amyloïde precursoreiwit, gegenereerd door de - en γ-secretase, een cruciale rol spelen bij het ontstaan ​​van AD (11, 12). Het amyloïde β42-peptide (Aβ42) is de variant die voornamelijk wordt aangetroffen in fibrilachtige afzettingen in de substancia nigra van de hersenen van AD-patiënten, samen met andere lengtevarianten (13). Hoewel wordt aangenomen dat aggregaten met een laag molecuulgewicht, bekend als oligomeren, de toxische soorten zijn tegen neuronale celfuncties (14), hebben systematische kinetische analyses aangetoond dat de secundaire nucleatieroute een sleutelrol speelt bij het genereren van Aβ42-oligomeren (15, 16) . De omzetting van monomeer in giftige oligomere soorten wordt dus gekatalyseerd door het oppervlak van fibrillen (voor een recent overzicht, zie ref. 17).

Hoewel er momenteel geen effectieve behandelingen beschikbaar zijn (14), heeft de Food and Drug Administration (FDA) onlangs het antilichaam Aducanumab (18) goedgekeurd, dat de hoeveelheid amyloïd in de hersenen vermindert, evenals klinische symptomen (19, 20) en de vorming van toxische oligomeren remt door oppervlakte-gekatalyseerde kiemvorming (21).

Het ontcijferen van de structuur van Aβ-fibrillen zal van belang zijn voor het ontwerp van toekomstige therapieën.

Verstrooiing onder een kleine hoek is een krachtige en nuttige techniek voor het onderzoeken van de structuur van materie op de nanometer-lengteschaal (22) inclusief de studies van amyloïde fibrillen (23). Het is dus een aanvulling op directe beeldvormingstechnieken, zoals transmissie-elektronencryomicroscopie (cryo-TEM) (24, 25), met als bijkomend voordeel dat het in wezen niet-destructief is, afgezien van stralingsschade die bij hoge temperaturen een ernstig probleem kan zijn. schittering synchrotron bron, en men meet de structuur direct in oplossing.

De structuur van Aβ42-fibrillen is bestudeerd met behulp van solid-state nucleaire magnetische resonantie (ss-NMR) (1⇓ –3) spectroscopie, cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) (4, 26) en atoomkrachtmicroscopie (AFM) ( 27⇓ –29).

Deze methoden bieden informatie op verschillende structurele niveaus, variërend van korte afstand en atomaire resolutie van de filamentkern tot waarnemingen op langere schaal, zoals het aantal filamenten per fibril, knoop-tot-knoop afstand en fibrillengte. Verschillende onafhankelijke onderzoeken onthulden sterk vergelijkbare structurele modellen met parallelle kruis-β-structuur in neutrale of licht basische fosfaatbuffer (1⇓ -3), wat een stabiele en reproduceerbare fibrilvouw impliceert. Een verandering in de oplossingsomstandigheden naar een sterk zuur water-acetonitrilmengsel bleek echter een heel andere vouw (4) te hebben voor fibrillen met een kleine breedte van 7,4 ± 0,4 nm en een korte cross-over (knooppunt-naar-knooppunt) afstand of 41,5 ± 2,3 nm. Recente AFM-onderzoeken op rijpe Aβ42-fibrillen suggereren een stijve cilindrische structuur met een gemiddelde diameter van 9,6 ± 0,7 nm (30). afb. 1 illustreert een amyloïde fibril, de structurele hiërarchie ervan en het informatieniveau dat met verschillende methoden kan worden verkregen.

Cartoon ter illustratie van een (grijs) fibril met zijn twee filamenten in licht- en donkergrijs. De afstand van knoop tot knoop kan worden verkregen van AFM of cryo-EM, die ook informatie kan geven over de gedetailleerde verpakking. Rechts wordt een uitgesneden doorsnedevlak getoond, waarvan de afmetingen zijn bestudeerd door SAXS en SANS, met de kernen van de twee filamenten in tegel en lichtcyaan. Boven de doorsnede wordt één vlak van elk filament getoond, van bovenaf gezien, gebaseerd op de ss-NMR-structuur (1) PDB ID 5KK3, DOI: 10.2210/pdb5KK3/pdb, met één filament als ruimtevullend model en de andere als ruimtevullend model met de ruggengraat van de twee monomeren geschetst. Onder de dwarsdoorsnede wordt één vlak van de fibril getoond met de ruggengraat van alle vier de monomeren omlijnd en de flexibele N-termini aangegeven door cyaan ovalen, zoals gemodelleerd in het huidige werk. (Gemaakt met BioRender.com.)

ss-NMR-onderzoeken van recombinante 13C- en 15N-gelabelde Aβ42-fibrillen (1, 2) onthulden dat elk vlak in een filament twee monomeren bevat met een significant aantal begraven hydrofobe zijketens. Dergelijke vlakken stapelen zich op elkaar langs de voortplantingsas van het filament en de sterk georganiseerde hydrofobe kernen zijn continu in de fibril over de gehele lengte. De filamentkern wordt gevormd door aminozuurresten 15 tot 42 (20 van deze 27 resten zijn hydrofoob); ss-NMR biedt echter weinig structurele informatie over het meer flexibele N-terminale gebied (1), waar een beperkt aantal afstandsbeperkingen alleen voor residuen 11 tot 14 wordt gezien. Bovendien, omdat ss-NMR alleen beperkingen op korte afstand biedt, kan het geen informatie onthullen over de assemblage van filamenten in de fibril.

In dit kader kunnen kleine-hoekröntgenstraling (SAXS) en neutronenverstrooiing (SANS) aanvullende informatie verschaffen die niet toegankelijk is voor ss-NMR, cryo-EM of AFM (31). Onderzoeken naar verstrooiing onder een kleine hoek en röntgenvezeldiffractie zijn gerapporteerd voor synthetische amyloïde-achtige peptiden en in aanwezigheid van organische oplosmiddelen (5, 32⇓ –34).

In dit werk presenteren we SAXS/SANS-gegevens die zijn verkregen voor recombinante Aβ42-fibrillen in waterige fosfaatbufferoplossing bij fysiologische pH. De experimentele SAXS-gegevens worden ook vergeleken met simulaties, gebaseerd op de lokaal gevouwen ss-NMR-structuur van Aβ42-filamenten, om een ​​model van de fibrilstructuur te verkrijgen.

De SAXS-patronen van 350 M Aβ42-fibrillen, gevormd bij respectievelijk pH = 7,4 en 8,0, worden weergegeven in Fig. 2. Zoals te zien is, zijn de twee patronen in wezen identiek, zowel in vorm als in absolute intensiteit. Gecombineerde SAXS/groothoek röntgenverstrooiing (WAXS) experimenten werden uitgevoerd in een q-bereik van 0,004 tot 2 1, waarbij q = 4πsin(θ/2)/λ de grootte van de verstrooiingsvector is, waarbij θ de verstrooiingshoek. In het experimentele q-bereik rapporteert het SAXS-patroon voornamelijk over de grootte en vorm van de fibrildoorsnede, die duidelijk hetzelfde zijn bij de twee pH-waarden. In afb. 2 tonen we als inzet ook de WAXS-patronen. Hier zien we in beide gevallen een relatief scherpe reflectie bij q = 1,3 Å−1 overeenkomend met de periodieke β-strengscheiding, dβ=2π/q= 4,7 Å naast een bredere bult, gecentreerd op q = 0,6 Å−1 , die rapporteert over een karakteristieke afstand van 10 in de pakking loodrecht op de fibril-as (35). De β-strengscheiding van 4,7 Å is een kenmerkend kenmerk van parallelle en antiparallelle β-sheets in gevouwen monomere eiwitten en in aggregaten (36, 37) en wordt ook waargenomen in het geval van β-sheet-aggregaten van korte peptiden (38 , 39). Interessant is dat de karakteristieke afstand van 10 Å ook wordt waargenomen voor β-sheet-aggregaten van het kernsegment Aβ (16⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ -22, 40), waar deze duidelijk overeenkomt met de scheiding tussen β-sheets in een tweedimensionale (2D) kristallijn rooster (40).

(A) Absoluut geschaalde SAXS-patronen van Aβ42-fibrillen gevormd bij pH 7,4 (cirkels) en 8,0 (driehoeken). De ononderbroken lijn is een berekend verstrooiingspatroon, waarbij de fibrillen zijn gemodelleerd als elliptische cilinders. De inzet toont het WAXS-patroon, waarbij de stippellijnen de reflecties aangeven bij respectievelijk q = 1,3 en 0,6 1. (B) Schematische weergave op schaal van Aβ42 fibril doorsnede-afmetingen verkregen door SAXS/WAXS (lichtblauwe kleur) en Aβ42 filamenten-kernafmetingen (residuen 15 tot 42) verkregen door ss-NMR (lichtrode kleur). Residuen 0 tot 14, weergegeven in het wit, zijn flexibel en blootgesteld aan het oplosmiddel. (Gemaakt met BioRender.com.)

De fibrillen zijn erg lang met een totale lengte L≫qmin−1 , waarbij qmin de minimale q-waarde is die toegankelijk is in het experimentele q-bereik. Daarom kan L niet worden gemeten in de huidige experimenten, afgezien van het feit dat de fibrillen elkaar overlappen en een netwerk vormen. Bovendien kan, vanwege de grote L, de fibrilvormfactor worden ontbonden in een product van totale lengte en bijdragen aan de dwarsdoorsnede (41). Met L≫qmin−1 kunnen we de verstrooide intensiteit van het model schrijven alsI(q)=CqPc(q), [1] waarbij Pc(q) de genormaliseerde 2D-doorsnedevormfactor is, en C wordt gegeven doorC=πΔρ2ϕVpL. [2] Hier is Δρ=ρp−ρb het dichtheidsverschil in verstrooiingslengte tussen eiwit (p) en buffer (b), ϕ is de fibril (eiwit) volumefractie, en Vp/L is het eiwitvolume per lengte-eenheid in de fibrillen (Vp is het totale eiwitvolume in een fibril en L is de fibrillengte). De lengtedichtheden van de röntgenverstrooiing worden gegeven door respectievelijk ρp = 13 1010 cm−2 en ρb = 9,5 1010 cm−2. De vormfactor van de genormaliseerde doorsnede van een elliptische cilinder kan worden geschreven alsPc(q)=2π∫0π/2dφ(2J1(qr)qr)2. [3] Hier is J1(x) de eerste orde Bessel-functie en r=((asin⁡φ)2+(bcos⁡φ)2)1/2, [4] en r is een effectieve straal die varieert met de polaire hoek. vgl. 3 wordt verkregen uit het cilindermodel met volledige elliptische dwarsdoorsnede dat bijvoorbeeld wordt gegeven in ref. 42 na het uitvoeren van de factorisatie (Vgl. 1). Een elliptische doorsnede met kleine halve as a = 3,0 nm en grote halve as b = 9,0 nm bleek het SAXS-patroon naar tevredenheid te beschrijven. In de SI-bijlage vergelijken we met de cilindervormfactor van een cirkelvormige doorsnede met hetzelfde dwarsdoorsnede-oppervlak (SI-bijlage, afb. S5).

Vervolgens behandelen we de vraag hoeveel filamenten, N, er in de fibrilstructuur worden gevonden, waarbij elk filament is gemaakt van twee stapels gevouwen Aβ42-moleculen (dwz twee monomeren per vlak). We hebben dus Vp/L=2Nvp/dβ, [5] waarbij vp = 5,4 nm3 het moleculaire volume van Aβ42 is, uitgaande van een massadichtheid van 1,43 g/cm3 (42).

Getoond als een ononderbroken lijn in Fig. 2 is het resultaat van een modelberekening uitgaande van een elliptische doorsnede met a = 3,0 nm, b = 9,0 nm (axiale verhouding b/a = 3), en n = 2 (SI Appendix, Tabel S1). Zoals te zien is, beschrijft dit eenvoudige model de gegevens ruim binnen het experimentele q-bereik. We zien een kleine afwijking bij lagere q-waarden, waar het model de aq−1-afhankelijkheid benadert, terwijl de experimentele data een iets steilere stijging laten zien. We schrijven dit toe aan de aanwezigheid van aantrekkelijke fibril-fibril-interacties, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van hydrofobe interacties (43). De oorsprong van vergelijkbare effecten is onlangs geanalyseerd voor α-synucleïnefibrillen (6). We zien ook een kleine afwijking in het q-bereik van 0,1 tot 0,3 Å−1. Dit komt door de oscillaties in de modelvormfactor die voortkomen uit het veronderstelde scherpe grensvlak tussen de elliptische modelcilinder en het oplosmiddel, wat resulteert in een discontinue verandering in de dichtheid van de verstrooiingslengte. In het echte systeem is de interface tussen fibril en oplosmiddel meer diffuus.

We kunnen dan concluderen dat elk eiwitmolecuul een 2D gevouwen structuur aanneemt in de fibrilkern, de fibrildoorsnede wordt gemaakt door tetrameren, en de moleculen stapelen zich op, met intermoleculaire β-sheets langs de fibrilrichting met een periodieke herhalingsafstand, dβ = 4,7 A.

We gaan nu verder met een meer gedetailleerde SAXS-gegevensanalyse en construeren een atomistisch model van de fibrillen. Om dit te doen, gebruiken we een ss-NMR-structuur [Protein Data Bank (PDB) ID 5KK3 (1)] als een model voor een enkel filament, waaruit we vervolgens een fibrilmodel bouwen dat bestaat uit twee filamenten door de parameters te variëren die de spiraalvormige symmetrie van het systeem, zoals in detail beschreven in de materialen en methoden. Vervolgens werden op structuur gebaseerde verstrooiingsberekeningen gebruikt om te bepalen welk model het beste bij de experimentele gegevens past. Het ss-NMR-model omvat resten 11 tot 42 in elk Aβ42-monomeer, waarvan resten 15 tot 42 deel uitmaken van de geordende kern. Verstrooiingsberekeningen op basis van modellen zonder residuen 0 tot 14 resulteerden niet in curven die goed pasten bij de experimentele gegevens (SI-bijlage, Fig. S3), wat suggereert dat de N-termini aanzienlijk bijdraagt ​​aan de verstrooiing. We hebben verschillende conformaties van de N-terminus gemodelleerd met behulp van symmetrische lusmodellering. Elk monomeer in de Aβ42 wordt gevonden in een andere structurele omgeving. Daarom laten we toe dat de twee N-uiteinden van elk vlak in de gloeidraad, die de asymmetrische eenheid vormen, verschillende conformaties hebben. Dit resulteerde in een aanzienlijk betere pasvorm voor gegevens dan het aannemen van een enkele conformatie voor beide N-termini (SI-bijlage, figuur S3). Voor elk gegenereerd model hebben we Pepsi-SAXS (44) gebruikt om de verstrooiingscurve te voorspellen en deze te vergelijken met de experimentele gegevens. Een diep minimum van χ2 werd gevonden voor de vrijheidsgraad die overeenkomt met de rotatie van de asymmetrische eenheid, die bepaalt welke residuen worden gevonden op het grensvlak tussen filamenten (SI-bijlage, Fig. S3). Pogingen om rekening te houden met conformationele flexibiliteit door de gegevens aan te passen aan een structureel ensemble in plaats van aan een enkele structuur, leidden niet tot verbeteringen in de pasvorm. Dit suggereert dat het model de gemiddelde conformatie van de termini-put weergeeft. De gemodelleerde uiteinden bemonsteren een reeks conformaties van compact tot uitgebreid. De best passende modellen hebben consequent de twee N-termini in verlengde conformaties. Ook bevinden de C-terminale carboxylaatgroepen zich op twee verschillende locaties met de C-uiteinden van twee van de vier monomeren op het grensvlak tussen filamenten. Elke Ala42 C-terminale carboxylaatgroep staat in nauw contact met de terminale aminogroep van een Lys28-zijketen, wat betekent dat deze opstelling waarschijnlijk geen netto elektrostatische afstoting tussen de filamenten zal veroorzaken. In afb. 3, wordt de beste modelfit samen met het experimentele SAXS-patroon uitgezet bij pH = 7,4. Zoals te zien is, is er een goede overeenkomst tussen de pasvorm van het model en de experimentele gegevens, wat een sterke ondersteuning geeft voor de twee-filamenten fibrilstructuur, waarin de filamentkernstructuur wordt gegeven door de moleculaire vouw verkregen uit ss-NMR.

(A) Experimenteel SAXS-profiel voor Aβ42-fibril in 20 mM natriumfosfaatbuffer bij pH = 7,4 (paarse cirkels), uitgezet samen met de beste pasvorm van het atomistische model door Pepsi-SAXS (roze lijn) en de elliptische cilindermodelberekening (blauw puntjes). (B) Illustratie van de atomistische modelstructuur van de fibrillen gemaakt door twee filamenten. (C) Een fibril Bovenaanzicht illustreert de fibril-dwarsdoorsnede gemaakt door tetrameer-eenheden (monomeren 1 tot 4, kleurgecodeerd) die β-vellen vormen die langs de fibril-as zijn gestapeld. (D) Zoom van Aβ42-fibrilkern die de aminozuurresiduen van contact tussen filament 1 en 2 toont.

In afb. 3, vergelijken we ook met het analytische continuüm elliptische cilindermodel. Zowel de vormfactor van het continuümmodel als de vormfactor van het discrete atomistische model vertonen kleine oscillaties voor q> 0,1 Å−2, die niet aanwezig zijn in de experimentele gegevens. Zoals hierboven vermeld voor het geval van het continuümmodel, is de oorsprong van de oscillaties de veronderstelde scherpe fibril-oplosmiddelinterface. In het geval van het atomistische model rapporteren de oscillaties daarentegen over een interne variatie in de elektronendichtheid binnen de fibril met vaste posities van de atomen. In het echte systeem verwachten we dat thermische fluctuaties veel van dergelijke functies zullen uitsmeren.

Het is intrigerend dat in vitro-onderzoeken van synthetische peptiden aantonen dat Aβ42-fibrillen als verschillende polymorfen kunnen bestaan ​​als gevolg van veranderingen in de aminozuursequentie of experimentele omstandigheden (45). De aminozuursequentie zou dus kunnen dicteren welk segment van de keten de amyloïdekern en de fibrilpakking vormt. Aan de andere kant kan polydispersiteit op basis van het aantal en de rangschikking van de filamenten optreden zonder veranderingen in de volgorde en lijkt sterk afhankelijk van de voorbereiding van het fibrilmonster (27). Recente cryo-EM-onderzoeken op fibrilextracten van AD-patiënten rapporteren polydispersiteit van van hersenen afgeleide Aβ-fibrillen (26). Er werden drie belangrijke fibrilmorfologieën gevonden, gemaakt door respectievelijk één, twee of drie filamenten. Daarentegen tonen onze SAXS-onderzoeken naar Aβ42-fibrillen gevormd in fosfaatbufferoplossing bij pH 7,4 en 8,0, met of zonder thioflavine T, een fluorescerende kleurstof die gewoonlijk wordt gebruikt om amyloïde fibrillen te detecteren, of in buffer met verschillende contrasten, herhaaldelijk een dwarsdoorsnede die overeenkomt met tot twee filamenten. Het polymorfisme van hersenafgeleide fibrilstructuren verkregen van AD-patiënten kan een echt polymorfisme in de hersenen weerspiegelen, of kan gedeeltelijk het resultaat zijn van de extractieprocedures. Onze bevindingen suggereren dat wanneer Aβ42-fibrillen in vitro worden gevormd uit recombinant peptide onder rustige omstandigheden, er weinig polydispersiteit is met betrekking tot het aantal filamenten per fibril en alleen de twee-filamentstructuur (Fig. 3) wordt verkregen.

In totaal werden vijf verschillende kleine-hoekverstrooiingsexperimenten op Aβ42-fibrillen uitgevoerd. Afgezien van de SAXS-gegevens getoond in FIG. 2 werden SAXS / WAXS-experimenten ook uitgevoerd in aanwezigheid van thioflavine T (SI-bijlage, Fig. S1) om te onderzoeken of de aanwezigheid van de kleurstof de fibrilmorfologie beïnvloedde. Verder werden aanvullende SAXS- en SANS-experimenten uitgevoerd op fibrillen in zwaar water (100% D2O-buffer), zoals weergegeven in SI-bijlage, Fig. S2. Alle kleine-hoekverstrooiingsgegevens die in dit werk worden gepresenteerd, zijn consistent met de twee-filament fibrilstructuur. De vier monsters die door SAXS zijn bestudeerd, hebben in wezen identieke verstrooiingspatronen (SI-bijlage, figuren S1 en S2). Dit suggereert dat de structuur met twee filamenten een minimum aan vrije energie zou kunnen vertegenwoordigen dat diep genoeg is om een ​​reproduceerbare en monodisperse fibrilmorfologie te vertonen. De interessante vraag die zich dan voordoet, is de volgende: waarom is er een minimum aan vrije energie voor een vezelstructuur met twee filamenten in plaats van één of drie? En wat zijn de belangrijke interacties, waarvan de balans verantwoordelijk is voor de waargenomen fibrilmorfologie?

De afzonderlijke filamenten lijken te bestaan ​​uit twee gedraaide stapels gevouwen Aβ42-moleculen. De interacties die deze twee stapels bij elkaar houden, werden besproken in ref. 1 en zijn voornamelijk hydrofobe interacties. Ook, zoals geconcludeerd in ref. 1 toont het dimeer-filament hydrofobe plekken, die de zijketens van V18, A21, V40 en A42 bevatten, zichtbaar op het oppervlak. Als deze vier resten worden vervangen door polaire (serine), neemt de fibril nog een vouw en worden andere hydrofobe plekken op elk filament zichtbaar (46). Het is dus waarschijnlijk dat de aantrekkingskracht die de twee filamenten bij elkaar houdt het gevolg is van hydrofobe interacties en dat deze filament-filament-interacties de vouw van elk filament stabiliseren. Met hydrofobe aantrekkelijke filamenten is de vraag wat het aantal filamenten tot een optimale waarde beperkt. We merken op dat amyloïde fibrillen in het algemeen een doorsnede van ongeveer 10 nm hebben, wat aangeeft dat er een algemeen mechanisme kan zijn om de breedte van de doorsnede te beperken. Een waarschijnlijke verklaring voor een beperkte breedte (laag aantal filamenten) kan in feite worden afgeleid van de twist als gevolg van chiraliteit (38, 47) maar ook van de aantrekkelijke hydrofobe interacties (48) als gevolg van het toenemende contact tussen filamenten . Bovendien kunnen elektrostatische interacties een rol spelen (49, 50). Het draaien van filamenten rond een centrale as omvat een vervorming van de β-sheet waterstofbruggen. De vervorming neemt toe met de afstand tot de centrale as en daarmee de totale fibrilradius (38, 47) en werkt als een beperkende factor voor de fibrildoorsnede-afmeting en dus het aantal filamenten. In wezen werden onlangs dezelfde argumenten aangevoerd om de eindige breedte van peptidelintaggregaten te verklaren met behulp van een kwantitatief thermodynamisch model (38).

Alle chemicaliën en reagentia waren van analytische kwaliteit en werden zonder verdere zuivering gebruikt. Bufferoplossingen werden bereid met deuteriumoxide (99% D-isotoopzuiverheid, Sigma-Aldrich) en gedeïoniseerd water met een weerstand van niet meer dan 18,2 MΩ cm−1.

Aβ(M1-42) peptide, MDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA, hier Aβ42 genoemd, met een molaire massa van 4,645 g ⋅mol−1, werd tot expressie gebracht in Escherichia coli en gezuiverd uit inclusielichamen zoals beschreven (15, 51, 52). De geïsoleerde monomeren werden in porties verdeeld, gevriesdroogd en het poeder bewaard bij -20 ° C.

Aliquots van Aβ42 werden opgelost in 1 ml 6 M GuHCl bij pH 8,4 en het monster werd geïnjecteerd op een Verhoog 10/300 GL (GE Healthcare) kolom met een stroomsnelheid van 0,7 ml/min en geëlueerd in 20 mM ammoniumacetaat, pH 8,5. Aβ42 gelfiltratiefracties werden gevriesdroogd en het poeder werd opgelost in 20 mM natriumfosfaat, 0,2 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 0,02% NaN3 bij pH 7,4 bij een uiteindelijke monomeerconcentratie van 350 µM en een minimumvolume van 250 µL. Aβ42-monomeermonsters werden vervolgens gedurende 5 dagen bij 37 ° C onder rustige omstandigheden geïncubeerd om de eindtoestand van de aggregatie te verzekeren.

Elk monster (150 µL) werd geladen in een kwartscapillair met een diameter van 1 mm. Alle metingen zijn gedaan in een luchtledige ruimte bij een druk lager dan 1,6 mbar en bij kamertemperatuur en zijn uitgevoerd met een Saxslab Ganesha pinhole instrument, JJ X-ray System Aps (JJ X-ray) met een röntgenmicrobron (Xenocs ) en een 2D 300k Pilatus-detector (Dectris Ltd.). De verstrooiingsexperimenten zijn uitgevoerd met Cu Ka-straling met een golflengte (λ) van 1,54 A. Monsters werden gemeten op drie gegeven afstanden van monster tot detector, en de evolutie van het verstrooiingsprofiel werd gevolgd door data-acquisitie op verschillende tijdstippen om mogelijke fibrilsedimentatie te detecteren. De 2D-beelden van de Pilatus-detector werden azimutaal gemiddeld na aftrek van de donkere tellingen. De achtergrond, opgenomen in een capillair met buffer met hetzelfde contrast, werd afgetrokken van de verkregen eendimensionale verstrooiingsgegevens, I(q).

Atomistische modellering van fibrilstructuren was gebaseerd op de ss-NMR-structuur van Colvin et al. (1) (VOB-ID 5kk3). De ss-NMR-structuur omvat residuen 11 tot 42 en omvat een korte sectie van een filament met 18 Aβ42-monomeren gerangschikt in twee nauw op elkaar inwerkende β-sheet-stapels. Een symmetrische versie van deze filamentsectie werd gegenereerd door de procedures beschreven in ref. 53. De twist van het filament mocht variëren van -4,4 tot 28 graden per vlak met behulp van een symmetrisch energieverfijningsprotocol (symmetrische relax) in Rosetta (54). De twistwaarde met de laagste Rosetta-energie werd gekozen, overeenkomend met 0 graden. Het minimum van 0 graden wordt verwacht omdat het model een voorkeursdraaihoek verwaarloost (38, 47).

Vervolgens hebben we een model gebouwd van een fibril die is samengesteld uit twee filamenten, ondersteund door de afmetingen van de dwarsdoorsnede van de elliptische cilinder die compatibel is met de SAXS-gegevens. Twee Aβ42-monomeren, van het symmetrisch geoptimaliseerde model met één filament, werden gebruikt als de kleinste herhalende eenheid voor het bouwen van de structuur met twee filamenten met spiraalvormige symmetrie. Het model met dubbele helix, gevormd uit twee filamenten, bevatte 79 herhalende eenheden (elk met twee Aβ42-monomeren) en had een lengte van ongeveer 230 Å. De vrijheidsgraden die bij het modelleren van deze helix werden onderzocht, waren de afstand tussen de twee filamenten van de helix, de draaiing en de rotatie van de asymmetrische eenheid (die bepaalt welke delen van de Aβ42-dimeren zich dicht bij elkaar bevinden). Om de optimale twist te bepalen, werden verschillende modellen met verschillende twistwaarden geconstrueerd met spiraalsymmetrie. De twistwaarde werd gevarieerd binnen het bereik geschat op basis van elektronenmicroscopiegegevensrapportage, respectievelijk 2,6 ± 2 graden (55) en 1,2 ± 0,2 graden (56) per vlak. De waarde (1,0 graad) die de laagste Rosetta-energie geeft na symmetrische ruggengraatverfijning, werd gebruikt in de daaropvolgende modellering. Deze analyse suggereerde een rechtshandige draai van 1 graad. Om de afstand tussen de twee filamenten te optimaliseren, werd de rotatie van de dimere Aβ42 asymmetrische eenheid geëvalueerd van 0 tot 360 graden in stappen van 10 graden. Voor elke rotatie werd de optimale afstand bepaald door de afstand tussen de twee filamenten te rasteren. De afstand die aanleiding gaf tot de laagste Rosetta-energiewaarde werd gebruikt voor verdere modellering.

Het ss-NMR-model suggereert een hoge orde voor residuen 15 tot 42, meer variatie voor residuen 11 tot 14 en geen informatie voor residuen 1 tot 10. In dit werk hebben we verschillende conformaties van residuen 1 tot 11 van de N-terminus gemodelleerd door symmetrische lusmodellering op de symmetrische fibrilstructuur (één streng) met behulp van de lusmodeltoepassing in Rosetta. Deze modellering werd gedaan in de grofkorrelige zwaartepuntmodus, gevolgd door toevoeging van zijketens met behulp van de Rosetta-zijketenoptimalisatieprocedure. Een eenheid bestaande uit twee monomeren van een enkel filament werd vervolgens gebruikt als de herhalende eenheden voor het modelleren van de dubbele filamentvezel. Elke herhalende eenheid heeft twee N-termini die zich in twee verschillende chemische omgevingen in de structuur zullen bevinden. We lieten deze twee uiteinden verschillende conformaties hebben, wat de fit met gegevens aanzienlijk verbeterde. Voor elke rotatie evalueerden we 100 verschillende conformatie van het uiteinde van elk van de twee Aβ42-monomeren. Alle combinaties werden vervolgens gegenereerd, resulterend in 10.000 modellen (100 × 100) per omwenteling. Het voorspelde model werd geselecteerd door het model te identificeren met de minimale χ2 tussen verstrooiing voorspeld op basis van het model en de experimentele gegevens. Omdat het lage q-gebied voornamelijk wordt bepaald door de lengte van het fibrillaire model, hebben we vergeleken met experimentele gegevens voor q> 0,18 1. Pepsi-SAXS (44) werd gebruikt om het verstrooiingsprofiel, I(q), uit de atomistische modellen te berekenen.

Alle onderzoeksgegevens zijn opgenomen in het artikel en/of SI-bijlage.

Dit werk werd ondersteund door de Zweedse Onderzoeksraad (VR 2015-00143 tot SL).

Auteursbijdragen: VL, UO en SL ontworpen onderzoek; VL en IA deden onderzoek; UG en MD droegen bij tijdens neutronenbundeltijd bij Paul Scherrer Institut; SL heeft nieuwe reagentia/analysetools bijgedragen; VL en IA analyseerden gegevens; en VL, UO en SL schreven het artikel.

Verklaring van concurrerende belangen: SL is een oprichter en medewerker van Wren Therapeutics Ltd.

Dit artikel is een directe inzending van PNAS.

Dit artikel bevat ondersteunende informatie online op https://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.2112783118/-/DCSupplemental.

Dit open access-artikel wordt gedistribueerd onder Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives License 4.0 (CC BY-NC-ND).

Bedankt voor uw interesse in het verspreiden van het woord over PNAS.

OPMERKING: we vragen alleen om uw e-mailadres zodat de persoon aan wie u de pagina aanbeveelt, weet dat u deze wilt zien en dat het geen ongewenste e-mail is. We leggen geen e-mailadres vast.

Feedback Privacy/Juridisch

Copyright © 2021 Nationale Academie van Wetenschappen. Online ISSN 1091-6490. PNAS is partner van CHORUS, COPE, CrossRef, ORCID en Research4Life.